Серологические исследования крови в диагностике болезней

Достоверность исследования

Важно помнить, что антитела к бледной спирохете начинают появляться в организме инфицированных людей через 2-4 недели после заражения, а в некоторых случаях этот срок может растягиваться и до 6 недель. По этой причине чувствительность анализа на РПГА на первичной стадии развития болезни составляет около 86%, что значительно уступает точности диагностики больных на двух следующих стадиях

Чувствительность анализа для таких пациентов, как и для носителей скрытого сифилиса, достигает 99-100%

По этой причине чувствительность анализа на РПГА на первичной стадии развития болезни составляет около 86%, что значительно уступает точности диагностики больных на двух следующих стадиях. Чувствительность анализа для таких пациентов, как и для носителей скрытого сифилиса, достигает 99-100%.

Однако реакция пассивной гемагглютинации имеет очень высокую специфичность, которая достигает уровня 96-100%.

Учитывая, что чувствительность трепонемных анализов, включая РПГА, существенно превышает чувствительность нетрепонемных методов, такие обследования стали все чаще назначать при проведении скрининговых анализов на сифилис. Однако при получении положительной реакции скринингового исследования для уточнения диагноза птребуется провести еще один специфический (трепонемный) анализ, но не РПГА.

Энциклопедический Словарь Вирусные Гепатиты

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ, РНГА(Indirect hemagglutination test)

— метод выявления антигенов и антител, основанный на способности эритроцитов, на поверхности которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток или соответствующих антигенов.

При обнаружении антигенов реакция обозначается обратной пассивной гемагглютинацией — РОПГА (reversed passive hemagglutination test), а при обнаружении антител — пассивной гемагглютинацией — РПГА (passive hemagglutination test). РНГА нашла широкое применение для выявления серологических маркеров инфицирования вирусом гепатита В, особенно HBsAg и антител к нему.

В настоящее время разработаны различные методы изготовления эритроцитарных диагностикумов, отличающихся по способам сенсибилизации эритроцитов (с помощью танина, глютарового альдегида, хлористого хрома, риванола и т.п. ), их видовой принадлежности (человека, барана, курицы, индюка и т. д. ), вариантам постановки реакции (в планшетах для микротитрования, в пробирках, капиллярах и т. д. ) и учета результатов (визуальный и инструментальный). Эритроцитарные диагностикумы для выявления HBsAg и анти-HBs выпускаются многими предприятиями и фирмами как у нас в стране, так и за рубежом.

Чаще РНГА проводится в планшетах для микротитрования, в которых предварительно приготовляются разведения исследуемой сыворотки и контрольных образцов. После внесения эритроцитарного диагностикума и инкубации проводится учет результатов реакции. Положительными считают образцы, в которых происходит агглютинация эритроцитов, имеющая вид перевернутого “зонтика”. При отрицательной реакции — эритроциты оседают на дно лунки в виде кольца или диска.

Для подтверждения специфичности полученных результатов реакция ставится как с “опытным” эритроцитарным диагностикумом (т. е. эритроциты, сенсибилизированные антигеном или антителами), так и с “контрольным” диагностикумом (т. е. эритроциты не сенсибилизированы антигеном или антителами). Наличие позитивной реакции с “контрольным” диагностическим препаратом свидетельствует о ложнопозитивной реакции. Для устранения неспецифических реакций исследуемую сыворотку обрабатывают несенсибилизированными эритроцитами. Обязательным условием проведения РНГА является реакция нейтрализации, т. е. конфирмационный тест.

По сравнению с такими методами, как РПГ, ВИЭФ и РСК, реакция непрямой гемагглютинации обладает более высокой чувствительностью (в 200 — 400 раз). Так, HBsAg в РПГА может быть выявлен в концентрациях 6-10 нг/ мл. Простота проведения реакции и экспрессность (20 — 30 минут) определили широкое применение данного метода в службе переливания крови для выявления HBsAg.

Кроме эритроцитарных диагностикумов для выявления HBsAg и анти-HBs разработаны диагностические препараты и для вы- явления анти-НВс, анти-НВс класса IgM (твердофазный вариант), HBeAg, антигена вируса гепатита А и антител к нему, однако, все они не нашли применения в практическом здравоохранении.

Р

Реакция гемагглютинации. Описание и применение

Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).

Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.

Другой тип РНГА — на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк — реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

• фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
• обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
• сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

• к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
• смесь оставляют на 2—3 ч при комнатной температуре или на 16—18 ч при 4 °С;
• учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.

РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

• обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
• обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа

Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса)

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Факторы вирулентности

Факторы
вирулентности хеликобактера

Способность H. pylori колонизировать слизистую желудка и вызывать гастрит либо язву желудка зависит не только от состояния иммунитета организма хозяина, но и от наличия
и количества у конкретного штамма бактерии специфических факторов
вирулентности, определяющих её специфическое взаимодействие с организмом хозяина
и её патогенность.

Одним из важных факторов вирулентности хеликобактер является наличие у
неё жгутиков, благодаря которым обеспечивается быстрое движение микроорганизма
в слое густой слизи, защищающей слизистую желудка от воздействия кислоты, её хемотаксис в места скопления других бактерий этого вида и
быстрая колонизация слизистой.

Липополисахариды и белки
наружной оболочки бактерии обладают свойством адгезии к наружной оболочке мембран клеток слизистой желудка.
Кроме того, липополисахариды наружной оболочки H. pylori вызывают
иммунный ответ организма хозяина и развитие воспаления слизистой.

Секретируемые бактерией во внешнюю среду литические ферменты — муциназа, протеаза, липаза — вызывают деполимеризацию и растворение защитной слизи
(состоящей в основном из муцина) и повреждение слизистой желудка.

Молекулярная модель уреазы H. pylori

Очень важную роль в вирулентности бактерии и в её способности выживать в
кислом содержимом желудка играет секреция бактерией уреазы — фермента, расщепляющего мочевину с образованием аммиака. Аммиак нейтрализует соляную кислоту желудка и обеспечивает
бактерии локальное поддержание комфортного для неё pH (около 6-7).
Одновременно с этим аммиак вызывает химическое раздражение и воспаление, а впоследствии и гибель, клеток слизистой
желудка.

Продукция хеликобактером различных экзотоксинов, в частности,
вакуолизирующего экзотоксина (продукта гена vacA), также вызывает вакуолизацию,
повреждение и гибель клеток слизистой желудка.

Специальная пилеобразная «инжекционная система», имеющаяся у
хеликобактер, предназначена для непосредственного впрыскивания в клетки
слизистой оболочки желудка различных эффекторных белков (в частности, продуктов
гена cagA), вызывающих воспаление, повышение продукции интерлейкина-8, угнетение апоптоза и избыточный рост определённых типов клеток.
Полагают, что именно этим обусловлена наблюдающаяся при хеликобактерной
инфекции гиперплазия париетальных (кислотообразующих) клеток желудка,
гиперсекреция соляной кислоты и пепсина, и в конечном итоге повышение вероятности рака
желудка.

Штаммы H. pylori, выделенные от больных с язвой желудка или
двенадцатиперстной кишки, как правило, проявляют большую биохимическую
агрессивность, чем штаммы, выделенные от больных с гастритом, а штаммы,
выделенные от больных с гастритом, обычно более агрессивны и вирулентны, чем
штаммы, выделенные от бессимптомных носителей. В частности, штаммы, выделенные
от больных с язвенной болезнью, чаще бывают cagA-положительными (то есть
продуцирующими cagA эффекторные белки). Штаммы, выделенные от больных с
гастритом, чаще продуцируют экзотоксин vacA, чем штаммы, выделенные от
бессимптомных носителей. Выше у патогенных штаммов также продукция уреазы,
муциназы, протеаз, липазы — соответственно выше продукция аммиака и способность
растворять и повреждать слизистую оболочку желудка.

Строение

Размеры
и схематическое строение H. pylori

Helicobacter pylori — спиралевидная грамотрицательная бактерия, около 3 мкм в длину, диаметром около 0,5 мкм. Она
обладает 4-6 жгутиками и способностью чрезвычайно быстро двигаться даже в
густой слизи или агаре. Она микроаэрофильна, то есть требует для своего развития
наличия кислорода, но в значительно меньших концентрациях, чем
содержащиеся в атмосфере.

Бактерия содержит гидрогеназу, которая может использоваться для получения
энергии путём окисления молекулярного водорода, продуцируемого другими кишечными бактериями. Бактерия также вырабатывает оксидазу, каталазу и уреазу.

Helicobacter pylori обладает способностью формировать «биоплёнки», в которых
внутренние слои защищены от действия кислоты и других вредных факторов наружным
слоем слизи и бактерий.Предполагают,
что это увеличивает её выживаемость в кислой и агрессивной среде желудка.

В неблагоприятных условиях, а также в «зрелых» или старых культурах Helicobacter
pylori обладает способностью превращаться из спиралевидной в круглую или шарообразную кокковидную
форму. Это благоприятствует её выживанию и может являться важным фактором в
эпидемиологии и распространении бактерии. Кокковидная форма бактерии не
поддаётся культивированию на искусственных питательных средах (хотя может
спонтанно возникать по мере «старения» культур), но была обнаружена в водных
источниках в США и других странах. Кокковидная форма бактерии также обладает
способностью к адгезии к клеткам эпителия желудка in vitro.

Реакция гемагглютинации РГА

Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.

В чём различия между поливалентными и моновалентными (монорецепторными) агглютинирующими сыворотками; почему при иммунизации кролика микробами одного вида получается сыворотка, содержащая антитела к нескольким антигенам?

Монорецепторные сыворотки — сыворотки, содержащие антитела толь­ко к одному антигену, и поливалентные сыворотки, дающие реакции аг­глютинации с двумя-тремя родственными бактериями, имеющими об­щий антиген. Агглютинирующие сыворотки применяют для идентификации микроорганизмов в реакции агглютинации. Недостатком таких сывороток является то, что они спо­собны давать групповые реакции агглютинации, т.к. они содержат ан­титела к бактериям, имеющим общие антигены.



РСК, РДСК сущность, способы постановки, хар-ка компонентов, практическоезначение

Биология » Иммунотерапия » РСК, РДСК (сущность, способы постановки, хар-ка компонентов, практическое
значение)

РСК используют для выявления а/т на определенный а/г или определяют тип а/г по известному а/т. Это сложная серологическая реакция, в ней участвуют две системы и комплемент. Первая система — бактериологическая (основная), состоит из антигена и антитела. Вторая система — гемолитическая (индикаторная). В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело). РСК ставят в два приема: вначале соединяют а/г с испытуемой сывороткой крови, в которой отыскивают а/т, а затем добавляют комплемент. Если а/г и а/т соответствуют друг другу, то образуется иммунный комплекс, который связывает комплемент. При отсутствии в сыворотке а/т иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Поскольку процесс адсорбции комплемента комплексом визуально невидимый, то для выявления этого процесса добавляют гемсистему. Р-цию учитывают если в первой системе комплемент связался, то при добавлении гемсистемы гемолиз эритроцитов не произойдет — р-ция положительная. Если же комплемент не связался в первой системе из-за отсутствия а/т, то он свяжется с гемсистемой, в

рез-те чего произойдет гемолиз эритроцитов — р-ция отрицательная. В основу РСК легли 2 явления – бактериолиз и гемолиз.

А/г для РСК готовят из убитых и разрушенных микробов, чаще путем экстрагирования. Комплемент — сыворотка морской свинки. Гемолизин – гипериммунизируют кроликов отмытыми эритроцитами барана.

РСК широко используют для диагностики бруцеллеза, риккетсиозов, ящура и многих других.

РДСК — это вариант обычной РСК, но отличающийся тем, что первая фаза р-ции протекает в течение 16—18 ч на холоде (4 °С). В таких условиях в первой системе в комплексе а/г-а/т- комплемент дополнительно связываются и холодовые а/т, что повышает чувствительность р-ции. Этот вариант используют для диагностики бруцеллеза, кампилобактериоза и др. Рез-ты выражают в крестах (задержка гемолиза, начиная с 4). Постановку РСК проводят классическим методом.

Другое по теме:

Определение содержания органических веществ

Для определения химического потребления кислорода (ХПК) берут 1-5 см3 профильтрованной воды, прибавляют 2,5 см3 0,25н раствора дихромата калия, 0,4 г сульфата ртути (II), 0,2-0,4 см3 сульфата серебра и при перемешивании приливают концентр …

Витамины

Открытие витаминов связано с именем русского ученого Н. И. Лунина, который в 1880 году экспериментально установил, что в пищевых продуктах имеются неизвестные факторы питания, необходимые для жизни. Он обнаружил, что белые мыши, получавши …

Спермициды

Спермициды относятся к классу химических контрацептивов.
Механизм действия спермицидов основан на способности активного ингредиента, входящего в их состав, разрушать сперматозоиды в течение нескольких секунд. Столь жесткое требование к в …

Историяназвания

Бактерия была вначале названа Campylobacter pyloridis, затем Campylobacter
pylori (после коррекции названия в соответствии с латинской грамматикой), и
только в году,
после того, как анализ последовательностей ДНК этой
бактерии показал, что в действительности она не принадлежит к роду кампилобактер,
её и близкие ей виды выделили в отдельный род, Helicobacter. Название pylōri
происходит от «pylorus» (привратник желудка, циркулярный жом, перекрывающий
проход из желудка в двенадцатиперстную кишку), которое, в свою очередь,
происходит от греческого слова πυλωρός,
означающего буквально «привратник».

Реакция гемагглютинации РГА.

В лаборатории пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения групп крови.

Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не

антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита — эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Реакцию проводят в пробирках или на специальных пластинках с лунками. Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным объёмом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5 мл изотонического раствора. Пробирки ставят на 30 минут в термостат, а пластины оставляют при комнатной температуре на 45 минут.

Учёт результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями («зонтик»), покрывающий всё дно лунки. При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями («пуговку»). Такой же осадок должен быть в контроле. Интенсивность реакции выражают знаками «+».

Виды серологических реакций

Жангу (1901), которые установили, что при образовании комплекса антиген — антитело происходит адсорбция комплемента. Вследствие того что этот процесс не определяется визуально, для выявления адсорбции (связывания) комплемента авторы использовали индикаторную гемолитическую систему — эритроциты барана, сенсибилизированные гемолитической антисывороткой кролика. При внесении сенсибилизированных эритроцитов в пробирку с исследуемой сывороткой, антигеном и комплементом гемолиз произойдет только при наличии свободного комплемента (реакция отрицательная). В случае, если комплемент адсорбировался на системе антиген — антитело, гемолиза не будет (реакция положительная).

РСК является одной из наиболее распространенных серологических реакций для определения природы и количества антител или антигенов ввиду своей высокой чувствительности и специфичности. Она применяется для серодиагностики бактериальных, риккетсиозных, вирусных и микоплазменных инфекционных заболеваний. Под названием «реакция Вассермана» РСК нашла широкое применение для серодиагностики сифилиса. Ее универсальность состоит в том, что она может быть использована для определения не только микробных айтигенов, но и других белков любого происхождения.

Реакция иммобилизации

Способность антисыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана со специфическими антителами, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. Иммобилизующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях. Это послужило основанием для разработки реакции иммобилизации трепонем, которая по своей чувствительности и специфичности превосходит другие серологические реакции, используемые при лабораторной диагностике сифилиса.

Реакция торможения гемагглютинации

Как уже отмечалось, многие вирусы (ортомиксовирусы, арбовирусы и др.) могут адсорбироваться на поверхности эритроцитов. Это изменяет поверхностные структуры и приводит к агглютинации эритроцитов. Реакция гемагглютинации не является иммунологической, поскольку она протекает без участия антисыворотки.

РТГА основана на способности антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный вирус не агглютинирует эритроциты.

РТГА широко применяется для серодиагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антигемагглютининов и для идентификации многих вирусов по их гемагглютининам (антигенам).

Реакция иммунофлюоресценции (Кунса).

Для выявления микробных антигенов в тканях или патологическом материале можно использовать меченую диагностическую сыворотку, содержащую антитела к определенным видам (вариантам) микроорганизмов (бактериям, вирусам и др.). Метку антител производят флюорохромами (изотиоцианат флюоресцеина и др.). Меченую антисыворотку наносят на фиксированный мазок, приготовленный из исследуемого материала. После тщательного промывания мазка на нем останутся только антитела, связавшиеся с антигеном, которые дают характерное свечение при люминесцентной микроскопии (прямой метод).

В связи с трудностями, которые встречаются при приготовлении широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, более доступным является непрямой метод Кунса. Его постановка требует лишь одной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, так как большинство диагностических сывороток приготовляется путем иммунизации кроликов. При образовании комплекса антиген — антитело флюоресцирующие антиглобулиновые антитела фиксируются на нем. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики, который по своей чувствительности и специфичности не уступает другим иммунологическим реакциям.



Расшифровка анализа

При добавлении сыворотки с антителами к трепонеме из материала человека, инфицированного сифилисом, к реагенту, с которым проводится исследование, происходит агглютинация эритроцитов, вследствие чего они выпадают в осадок.

На количество склеенных эритроцитов влияет уровень содержания антител в сыворотке. Поэтому пассивная гемагглютинация не только показывает присутствие антител, но и позволяет установить их количество. Результат исследования представлен уровнем титра антител.

Положительная реакция говорит о наличии возбудителя болезни в организме пациента. Однако в процессе проведения диагностики возможно появление ложноположительных реакций, количество которых статистически не превышает уровня 0,05-2,5% от общего числа исследований.

Положительная реакция РПГА у людей, не инфицированных сифилисом, может проявляться в случае наличия:

• системных заболеваний соединительной ткани,
• в крови пациента антител к возбудителям, похожим на бледную трепонему,
• физиологических патологий, например инфаркта миокарда,
• гепатита В или С,
• онкологических заболеваний,
• тифа, лептоспироза, туберкулеза,
• ВИЧ-инфекции,
• боррелиоза клещевой этиологии,
• обширных травм или переломов,
• беременности,
• в случае проведения инъекций наркотических препаратов.

В большинстве случаев ложноположительные реакции сопровождаются низким титром. Высокие показатели титра типичны для вторичной стадии болезни и ранее скрытого сифилиса. Однако они могут появиться и при ложноположительной реакции у пациентов со злокачественными новообразованиями.

Редкими исключениями могут служить те ситуации, когда болезнь была выявлена на ранней стадии развития, после чего была проведена интенсивная и эффективная терапия. Поэтому анализ РПГА не может использоваться для оценки динамики выздоровления или сравнительной диагностики ранней или поздней стадий болезни.

При получении положительной реакции необходимо обследовать членов семьи заболевшего человека и людей, вступавших с ним в половой контакт.

Отрицательная реакция может быть получена в следующих случаях:

• человек не болен сифилисом,
• неправильно взята кровь для исследования,
• после заражения прошло 2-4 недели, и выработка антител еще не началась.

В любом случае результат исследования необходимо оценивать в сочетании с дополнительными лабораторными и анамнестическими показателями.

Кому показан анализ

Врач может направить сдавать кровь на РПГА пациентов в следующих случаях:

• при наличии клинических проявлений сифилиса: язвенных высыпаний, увеличенных лимфоузлов, диффузной алопеции и других,
• при подозрении на возможное инфицирование в случае контакта с уже заболевшими людьми,
• доноров, желающих сдать кровь,
• людей, проходящих ежегодные профилактические осмотры или оформляющих санитарные книжки,
• пациентов с положительной реакцией скринингового теста,
• перед госпитализацией в стационарное лечебное учреждение,
• при предоперационном обследовании,
• для выявления возбудителей сальмонеллеза, дифтерии, дизентерии методом проведения РПГА с соответствующим диагностикумом.